A curva padrão é uma ferramenta crucial para determinar a concentração de uma substância numa solução. É um gráfico que traça a concentração de uma substância conhecida (o padrão) contra a sua absorvância medida. Para criar uma curva padrão, é necessário utilizar um espectrofotómetro, um dispositivo que mede a quantidade de luz absorvida por uma amostra num comprimento de onda específico.
Calibração do espectrofotómetro Antes de poder criar uma curva padrão, é necessário calibrar o espectrofotómetro para garantir leituras precisas. Para o efeito, é necessário utilizar uma solução em branco, que é uma solução que não contém a substância que pretende medir. Siga estes passos para calibrar o espectrofotómetro:
2. Colocar a cuvete no espectrofotómetro e regular o comprimento de onda para o valor pretendido.
Premir o botão “zero” ou programar o espectrofotómetro para ler a absorvância zero.
Retirar a cuvete do espectrofotómetro e adicionar a substância que se pretende medir à solução em branco.
Cálculo da absorvância
Depois de calibrar o espectrofotómetro, pode começar a criar a curva-padrão. Comece por preparar uma série de soluções com concentrações conhecidas da substância que pretende medir. Por exemplo, se estiver a medir glicose, pode preparar soluções com concentrações de 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mM.
Em seguida, medir a absorvância de cada solução com o espectrofotómetro no mesmo comprimento de onda utilizado durante a calibração. Registar os valores de absorvância numa tabela, juntamente com as concentrações correspondentes.
Por vezes, a substância que pretende medir pode ser difícil de separar das outras substâncias presentes na solução. Neste caso, pode ser necessário utilizar o método da adição padrão. Este método consiste em adicionar uma quantidade conhecida da substância à amostra e medir a absorvância. A curva de adição padrão é um gráfico que representa a quantidade de substância adicionada em função da alteração da absorvância.
Para criar a curva de adição de padrão, preparar uma série de soluções com quantidades crescentes da substância que se pretende medir. Adicionar cada solução à amostra e medir a absorvância. Traçar o gráfico da alteração da absorvância em função da quantidade de substância adicionada para criar a curva de adição de padrão.
Quantificação da glucose Uma vez criada a curva padrão ou a curva de adição padrão, pode utilizá-la para determinar a concentração da substância numa amostra desconhecida. Medir a absorvância da amostra com o espectrofotómetro e, em seguida, utilizar a curva padrão para encontrar a concentração correspondente. Por exemplo, se a absorvância da amostra corresponder a 0,5 mM na curva padrão, então a concentração da substância na amostra é de 0,5 mM.
Em conclusão, a criação de uma curva padrão é uma técnica essencial para determinar a concentração de uma substância numa solução. Seguindo os passos descritos neste guia, é possível criar uma curva padrão precisa e usá-la para quantificar a concentração da substância que está a estudar.
A função de uma curva padrão na quantificação de uma amostra utilizando o espectrofotómetro é estabelecer uma relação entre a concentração de uma substância conhecida e a absorvância da luz. Esta relação é então utilizada para determinar a concentração de uma amostra desconhecida, comparando a sua absorvância com a curva padrão. A curva padrão é criada medindo a absorvância de diferentes concentrações conhecidas da substância e traçando-as num gráfico.
Para preparar o reagente de Bradford, é necessário dissolver 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 em 50 ml de etanol a 95% e, em seguida, adicionar 100 ml de ácido fosfórico a 85%. Misturar bem a solução até a cor azul ficar uniforme. Em seguida, adicionar água destilada até obter um volume total de 1 litro e filtrar a solução através de papel de filtro. O reagente de Bradford pode ser armazenado à temperatura ambiente num frasco escuro até seis meses.
Para fazer uma curva de calibração no Origin, pode seguir os seguintes passos:
1. Abrir o Origin e criar um novo projecto.
2. Introduza os seus dados numa folha de cálculo.
3. Realce os dados que pretende utilizar para a sua curva de calibração.
4. Clique no menu “Analysis” (Análise) e seleccione “Peak Analysis” (Análise de picos) e depois “Calibration Curve” (Curva de calibração).
Na caixa de diálogo “Calibration Curve”, seleccione o tipo de curva que pretende utilizar (linear, quadrática, cúbica, etc.) e clique em “OK”.
6. O Origin criará automaticamente uma curva de calibração com base nos seus dados. Pode personalizar a curva ajustando as opções de ajuste da curva ou adicionando barras de erro.
7. Quando estiver satisfeito com a sua curva de calibração, pode utilizá-la para analisar outros conjuntos de dados ou para fazer previsões com base nos seus dados.
Nota: Estas etapas são gerais e podem variar ligeiramente dependendo da versão do Origin que estiver a utilizar.